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圖解中國(guó)藥典控制菌檢查法

更新時(shí)間:2021-08-24      點(diǎn)擊次數(shù):21018
  圖解中國(guó)藥典控制菌檢查法(二)
 
  方法適用性試驗(yàn)
 
  試驗(yàn)菌:根據(jù)供試品所需檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株,確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí),采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。
 
  依相應(yīng)的控制菌檢查方法,在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng),應(yīng)能檢出相應(yīng)控制菌。
 

 

  若未檢出試驗(yàn)菌,應(yīng)消除供試品的抑菌活性[見(jiàn)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查:微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)中的“抗菌活性的去除或滅活”],并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
 
  如果經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無(wú)法消除,可認(rèn)為受抑制的微生物不易存在于該供試品中,選擇抑菌成分消除相對(duì)*的方法進(jìn)行供試品的檢查。
 
  
 
  供試品檢查
 
  供試品的控制菌檢查應(yīng)按經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。
 
  陽(yáng)性對(duì)照:對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu,應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌?!灸湍扄}革蘭陰性菌檢查中的陽(yáng)性對(duì)照株使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌;梭菌檢查中的陽(yáng)性對(duì)照株使用生孢梭菌】
 
  陰性對(duì)照:以稀釋劑代替供試液,應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如果有菌生長(zhǎng),應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。
 
  
 
  3.1耐膽鹽革蘭陰性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)
 
  簡(jiǎn)述:耐膽鹽革蘭陰性菌是指能夠耐受膽鹽,在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的革蘭陰性桿菌,一般包括腸桿菌科、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等。其作為衛(wèi)生指標(biāo),與大腸菌群有類似的指示作用。對(duì)于非無(wú)菌產(chǎn)品而言,檢出耐膽鹽革蘭陰性菌或超標(biāo),指示生產(chǎn)工藝存在缺陷、原輔料受到污染、生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)緩解微生物污染控制措施失效等。
 
  在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的革蘭陰性桿菌
 

 

  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定選擇定性或定量方法。若標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為“不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌”,則選擇“定性試驗(yàn)”檢驗(yàn);若標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為“耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)<10n cfu/g(ml)”,則選擇“定量試驗(yàn)”檢驗(yàn)。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 

 

  通過(guò)選擇性增菌,紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌應(yīng)為革蘭陰性菌,但仍需進(jìn)行革蘭染色進(jìn)行確認(rèn)。
 
  陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌,并在接種EE的步驟加入對(duì)照菌。
 
  培養(yǎng)基:
 

 

  3.2大腸埃希菌(Escherichia coli
 
  簡(jiǎn)述:大腸埃希菌為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌,隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌,表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染,即可能污染腸道病原體。除普通大腸埃希菌外,尚有致病性大腸埃希菌,可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康,口服藥品必須檢查大腸埃希菌。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 



 

  大腸埃希菌檢查應(yīng)鑒定到水平。
 
  麥康凱液體的培養(yǎng)溫度為42~44℃,因?yàn)樵摋l件是區(qū)分大腸埃希菌和大腸菌群其他“種”的關(guān)鍵條件,另外有文獻(xiàn)報(bào)道表明:受到人和溫血?jiǎng)游锛S便污染的大腸埃希菌在42~44℃更容易生長(zhǎng)。
 
  大腸埃希菌在麥康凱瓊脂中的典型菌落形態(tài)特征:鮮桃紅色或微紅色,菌落中心呈深桃紅色,圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤(rùn)。
 

大腸埃希菌在麥康凱瓊脂上
 
  結(jié)果與判定:MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)可以作為確認(rèn)的參考方法。IMViC試驗(yàn)亦可以作為鑒定和確認(rèn)的參考。
 
  培養(yǎng)基:
 

 
  3.3沙門菌(Salmonella
 
  簡(jiǎn)述:沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌。在沙門菌的分類學(xué)研究和流行病學(xué)研究中,按照血清型進(jìn)行分類更為常見(jiàn),一般來(lái)說(shuō),O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95%,所以可以用沙門菌A-F O多價(jià)血清進(jìn)行沙門菌初篩試驗(yàn)。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 

 

藥品中的沙門菌,是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)。
 
  與其他控制菌相比,沙門菌檢查的取樣量較大(10g或10mL的供試品),經(jīng)方法適用性試驗(yàn),可適當(dāng)增加TSB的體積,消除可能的抑菌作用。
 
  使用RV培養(yǎng)基應(yīng)控制預(yù)增菌液的加入量,一般要求1:100 ~1:2000之間。
 
  沙門菌在XLD中典型菌落為淡紅色或無(wú)色、透明或半透明、中心有或無(wú)黑色。使用XLD時(shí)需注意:①培養(yǎng)超過(guò)48h可能造成某些微生物的假陽(yáng)性;②某些變形桿菌菌株可能會(huì)出現(xiàn)黑心菌落;③甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌可能會(huì)形成無(wú)黑心紅色菌落,與志賀氏菌混淆。
 
  在TSI高層斜面試驗(yàn)中,建議同時(shí)接種沙門菌、大腸埃希菌或其他類似腸桿菌科的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對(duì)照菌,輔助判斷斜面和底層的顏色反應(yīng)。
 



 

  沙門菌利用培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸使斜面先變黃,生成的少量酸接觸空氣氧化,同時(shí)利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,使斜面變紅。底層在缺氧狀態(tài)下,細(xì)菌分解葡萄糖生成的酸類一時(shí)不被氧化而仍保持黃色。
 
  培養(yǎng)基:
 

 

  3.4銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa
 
  簡(jiǎn)述:銅綠假單胞菌為假單胞菌屬菌種,本菌是常見(jiàn)的化膿性感染菌,在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染,優(yōu)于本菌對(duì)許多抗菌藥物具有天然的耐藥性,增加了治療的難度,國(guó)內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查被列為外用制劑的檢查項(xiàng)目之一。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 

 
  銅綠假單胞菌檢查應(yīng)鑒定到水平。
 
  溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(以下簡(jiǎn)稱“CA”)上若有菌生長(zhǎng),均需要鏡檢鑒定。典型的銅綠假單胞菌在CA上形成藍(lán)綠色菌落,在254nm的紫外燈下顯熒光;有個(gè)別株不產(chǎn)綠膿菌素,但在254nm的紫外燈下仍顯熒光。
 
  銅綠假單胞菌在CA上
 

 

  若需要進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn),可以進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn),判定如下圖。
 

 

 

培養(yǎng)基: 
 

 

  3.5金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus
 
  簡(jiǎn)述:金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種。本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶,這些毒性物質(zhì)能引起局部及全身化膿性炎癥,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥,是人類化膿性感染中重要的病原菌。金黃色葡萄球菌檢查是外用制劑的檢查項(xiàng)目之一。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 
 

 

  金黃色葡萄球菌檢查應(yīng)鑒定到水平。
 
  典型的金黃色葡萄球菌在MSA上呈黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落,而表皮葡萄球菌則能使培養(yǎng)基呈紅色。菌落呈黃色表示該菌很可能血漿凝固酶呈陽(yáng)性,而菌落呈紅色則表示血漿凝固酶呈陰性。
 
  除MSA外,還可以將疑似菌落劃線至Baird-Parker平板和血平板上。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、菌落直徑為2~3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、金黃色(有時(shí)為白色),菌落周圍可見(jiàn)*透明溶血圈。
 
  確證的關(guān)鍵試驗(yàn)為血漿凝固酶試驗(yàn),注意需同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照(金黃色葡萄球菌菌懸液)和陰性對(duì)照試驗(yàn)(空白培養(yǎng)液或稀釋液)。
 
  選擇性平板上為典型菌落,革蘭陽(yáng)性球菌,血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性,則判檢出金黃色葡萄球菌。
 

 

金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上
 
  培養(yǎng)基:
 

 

 

  3.6梭菌(Clostridia
 
  簡(jiǎn)述:梭菌屬主要病原菌有:產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌等,均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素使人和動(dòng)物治病。因此對(duì)于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品,必須控制梭菌。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 

 

  梭菌檢查需鑒別到水平。
 
  梭菌屬細(xì)菌芽孢體對(duì)外界的抵抗力強(qiáng),耐高溫耐干燥,對(duì)新霉素、卡拉霉素、慶大霉素等抗生素不敏感。因此將供試液在80℃保溫10分鐘后迅速冷卻,以殺死可能存在的雜菌繁殖體,使梭菌具有優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng);或在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中加入慶大霉素,抑制雜菌,利于梭菌的分離培養(yǎng)。
 
  梭菌革蘭染色鏡檢的典型形態(tài)特征為:培養(yǎng)后形成的芽孢,初呈“火柴頭”狀卵圓形,繼而膨大呈球形,在菌體末端如鼓槌狀。培養(yǎng)72小時(shí)以上時(shí),菌體可自溶而消失,僅見(jiàn)游離的芽孢囊,一般染色時(shí)呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢,大于菌體,著生于菌體中央、次端或頂端,為梭菌典型形態(tài)。
 
  鑒別梭菌的關(guān)鍵生化反應(yīng)為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn),梭菌應(yīng)呈陰性(無(wú)氣泡形成),可用枯草芽孢桿菌作為陽(yáng)性對(duì)照(有氣泡形成)。
 
  培養(yǎng)基:
 

 3.7白色念珠菌(Candida albicans
 

  簡(jiǎn)述:白色念珠菌又名白假絲酵母菌,屬假絲酵母菌屬。白色念珠菌是條件致病菌,是醫(yī)學(xué)全身性真菌感染病的重要組成之一,一旦感染,??梢鹦膬?nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中,目前國(guó)內(nèi)外藥品、食品標(biāo)準(zhǔn)已把白色念珠菌作為微生物檢驗(yàn)中酵母菌的代表均,因此有些藥品依據(jù)給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。
 
  試驗(yàn)步驟如下圖:
 

 

  白色念珠菌檢查應(yīng)鑒定到水平。
 
  白色念珠菌在SDA中呈乳白色,偶見(jiàn)淡黃色,表面光滑,有濃酵母氣味,培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大,顏色變深、質(zhì)地變硬或有褶皺。
 

         培養(yǎng)基:
 

 

      3.8補(bǔ)充說(shuō)明
 
  a.如果陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)中陽(yáng)性菌未生長(zhǎng),則表明檢驗(yàn)方法或檢驗(yàn)過(guò)程存在干擾因素,應(yīng)判斷無(wú)效,并進(jìn)行偏差調(diào)查,調(diào)查的因素包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、培養(yǎng)基的適用性檢查、試驗(yàn)器具的滅菌、檢驗(yàn)的潔凈環(huán)境、人員操作、方法適用性試驗(yàn)等。
 
  b.如果陰性對(duì)照試驗(yàn)有菌生長(zhǎng),表明試驗(yàn)過(guò)程存在污染可能,試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效,應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查,調(diào)查的因素包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、試驗(yàn)器具的滅菌、檢驗(yàn)的潔凈環(huán)境、人員操作等。
 
  c.在檢驗(yàn)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)有控制菌或不可接受微生物的檢出,則認(rèn)為是超標(biāo)或異常檢驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)立即啟動(dòng)OOS調(diào)查。對(duì)于藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)而言,OOS調(diào)查即實(shí)驗(yàn)室調(diào)查,包括影響檢驗(yàn)結(jié)果的所有因素,如試驗(yàn)人員、試驗(yàn)方法、取樣程序、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、試驗(yàn)器具、培養(yǎng)基、試驗(yàn)環(huán)境等,隨著調(diào)查結(jié)果和流程,可以延伸到其他部門。對(duì)于生產(chǎn)企業(yè)而言,OOS調(diào)查包括實(shí)驗(yàn)室調(diào)查和生產(chǎn)環(huán)節(jié)調(diào)查。實(shí)驗(yàn)室調(diào)查包括上述內(nèi)容,如果實(shí)驗(yàn)室調(diào)查認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效,則應(yīng)擴(kuò)大調(diào)查至生產(chǎn)環(huán)節(jié)。一般來(lái)說(shuō),生產(chǎn)環(huán)節(jié)的調(diào)查包括檢出菌特性分析(包括來(lái)源、危害、耐受性、是否會(huì)產(chǎn)生生物膜等)、檢出菌的數(shù)量評(píng)估、檢出菌在物料或終產(chǎn)品中的生長(zhǎng)特性分析、生產(chǎn)的某些工藝是否對(duì)檢出菌有抑制或殺滅作用、實(shí)驗(yàn)檢出相同菌的歷史調(diào)查、生產(chǎn)過(guò)程的詳細(xì)分析(包括原輔料、水系統(tǒng)以及包裝材料的檢驗(yàn)、物料的轉(zhuǎn)運(yùn)、生產(chǎn)工藝參數(shù)、包裝)等;通過(guò)生產(chǎn)調(diào)查,根據(jù)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估判斷該產(chǎn)品是否放行,并查找根本原因,制訂糾正和預(yù)防措施。
 
  參考:
 
  [1] 《中國(guó)藥典》2020年版四部 1106 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查:控制菌檢查法;
 
  [2] 《中國(guó)藥典》2020年版四部 9204微生物鑒定指導(dǎo)原則;
 
  [3] 《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2019年版。
 
  
 
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